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Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 7962 (2022) Citer cet article

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L'activité d, d-transpeptidase des protéines liant la pénicilline (PBP) est la cible principale bien connue des antibiotiques β-lactamines qui bloquent la polymérisation du peptidoglycane. La destruction bactérienne induite par les β-lactamines implique des réponses complexes en aval dont les causes et les conséquences sont difficiles à résoudre. Ici, nous utilisons le remplacement fonctionnel des PBP par une l, d-transpeptidase insensible aux β-lactames pour identifier les gènes essentiels pour atténuer les effets de l'inactivation des PBP par les β-lactamines dans les bactéries en division active. Les fonctions des 179 gènes conditionnellement essentiels identifiés par cette approche s'étendent bien au-delà des partenaires de la l, d-transpeptidase pour la polymérisation du peptidoglycane pour inclure des protéines impliquées dans la réponse au stress et dans l'assemblage des polymères de la membrane externe. Les effets insoupçonnés des β-lactamines comprennent la perte de la liaison covalente médiée par les lipoprotéines qui relie la membrane externe au peptidoglycane, la déstabilisation de l'enveloppe cellulaire malgré la réticulation efficace du peptidoglycane et l'augmentation de la perméabilité de la membrane externe. Ce dernier effet indique que le mode d’action des β-lactamines implique une pénétration auto-stimulée à travers la membrane externe.

Les bactéries à Gram négatif, telles que Escherichia coli, possèdent une enveloppe multicouche qui maintient la pression de turgescence du cytoplasme (peptidoglycane de la paroi cellulaire) et agit comme une barrière chimique sélective pour les nutriments, les déchets et les composés toxiques (membranes internes et externes) (Fig. .1a)1. Plusieurs polymères contenant des fragments protéiques, peptidiques, glycanes et lipidiques assurent les propriétés mécaniques et les fonctions de transport de l'enveloppe. Le peptidoglycane (PG), qui est lié de manière covalente à la membrane externe via la lipoprotéine de Braun, est une macromolécule géante en forme de filet (environ 109 Da) polymérisée à partir d'une unité disaccharide-pentapeptide (Fig. 1b). Les glycosyltransférases catalysent la formation de liaisons glycosidiques β−1,4 entre les disaccharides pour former des chaînes de glycanes qui sont ensuite réticulées les unes aux autres par des transpeptidases (Fig. 1c). Ces dernières enzymes, les d,d-transpeptidases, sont également appelées protéines liant la pénicilline (PBP) car elles sont les cibles essentielles des antibiotiques β-lactamines. Pour la polymérisation du peptidoglycane, les PBP interagissent avec l'extrémité d-Ala4-d-Ala5 d'une tige pentapeptidique (d'où la désignation d,d) et forment un lien covalent entre d-Ala4 et leur résidu Ser du site actif avec la libération concomitante de d -Ala5. Dans l'étape suivante, l'acyl-enzyme résultante réagit avec le deuxième substrat, le plus souvent une tige tétrapeptide, pour former un dimère Tetra-Tetra réticulé 4 → 3 avec la libération concomitante du PBP (Fig. 1c; Fig. S1a)2. En coopération avec les protéines d'échafaudage et les endopeptidases, les d,d-transpeptidases interviennent dans l'insertion de brins de glycane dans la macromolécule en forme de réseau PG en expansion, déterminant ainsi la forme bactérienne et assurant une barrière mécanique contre la pression osmotique du cytoplasme pendant toute la durée de la cellule. cycle3,4,5,6,7.

a L'enveloppe est composée de membranes intérieure (IM, grise) et extérieure (OM, noire). Le peptidoglycane (PG, bleu) assure la protection osmotique de la cellule bactérienne. L'IM est une bicouche lipidique composée principalement de phospholipides (PL). L'OM est une bicouche lipidique asymétrique : le feuillet interne est composé de PL et le feuillet externe de lipopolysaccharides (LPS) et de phosphatidylglycérides substitués par l'antigène commun entérobactérien (ECAPGL). b Structure de la sous-unité PG (GlcNAc, N-acétyl-glucosamine ; MurNAc, acide N-acétyl-muramique). c PG est une macromolécule en forme de réseau constituée de chaînes de glycanes (polygones bleu-violet) réticulées entre elles par de courtes tiges peptidiques (cercles colorés). Les PBP catalysent la formation de 4 → 3 liaisons croisées reliant la 4ème position d'une tige donneuse d'acyle à la 3ème position de l'accepteur. Deux membres de la famille LDT (YcbB et YnhG) catalysent la formation de 3 → 3 liaisons croisées. Trois LDT (ErfK, YbiS et YcfS) ancrent la lipoprotéine de Braun (Lpp) au PG. Relier le DAP en 3ème position d'une tige donneuse PG à l'extrémité Arg-Lys de la Lpp fournit un lien covalent entre l'OM et la PG. La liaison PG-Lpp est hydrolysée par le YafK LDT46,47. d Profil rpHPLC des muropeptides de la souche BW25113 (ycbB, relA') cultivés sans ceftriaxone. La structure est déduite des fragments obtenus par digestion de PG avec des muramidases qui clivent la liaison MurNAc-GlcNAc β−1,4. e Structure des muropeptides déduite des analyses par spectrométrie de masse. Les données sources sont fournies sous forme de fichier de données sources.

90% of the resulting muropeptides recycled by the cell37,38. This involves the retrograde transport of PG fragments into the cytoplasm by specialized permeases, AmpG and the Opp complex, followed by the recycling of the sugar and peptide moieties as glucosamine and tripeptide l-Ala-γ-d-Glu-DAP, respectively (Fig. 4a). Tn-seq analysis showed that genes encoding the AmpG permease and each component of the Opp complex were fully dispensable for growth both in −CRO and +CRO conditions. We further demonstrated that PG recycling was fully dispensable by constructing a ΔampG ΔoppF ΔmppA triple mutant that was found to be viable and resistant to ceftriaxone in spite of the loss of both transporters (Supplementary Fig. S3a). Nevertheless, the cytoplasmic l,d-carboxypeptidase LdcA was essential in the +CRO but not in the −CRO condition (Supplementary Data File 1b; Supplementary Data File 2). This enzyme was previously shown to trim d-Ala4 from recycled tetrapeptide stems to provide the l-Ala-γ-d-Glu-DAP tripeptide that is directly added to UDP-MurNAc by the Mpl ligase39,40. Disruption of the gene encoding LdcA was reported to result in bacteriolysis during stationary growth, attributed to dramatically decreased cross-linking as recycled tetrapeptide stems cannot serve as acyl donors by d,d-transpeptidases (Supplementary Fig. S1)40. The same explanation cannot account for the essential role of LdcA in ceftriaxone resistance since YcbB uses tetrapeptide stems as acyl donors8. Nonetheless, the essential role of LdcA in the +CRO condition stemmed from elimination of imported tetrapeptides since deletion of the mpl gene restored growth of the ΔldcA mutant in the presence of ceftriaxone (Supplementary Fig. S3a). Overexpressing murA, encoding the enzyme catalyzing the first committed step of PG synthesis (Fig. 4a), also restored resistance of the ΔldcA mutant (Supplementary Fig. S3b). Thus, boosting the metabolic flux trough the PG assembly pathway compensates for the toxicity of the imported tetrapeptides. Together, these results indicate that Mpl ligates the tetrapeptide onto UDP-MurNAc and that in the absence of LdcA the resulting tetrapeptide-containing precursors are ineffectively used in subsequent PG synthesis steps and impair the global efficacy of the pathway./p> 40-fold reduction of the MIC of the detergent (Fig. 6b). Growth in the presence of ceftriaxone also increased susceptibility to vancomycin, moenomycin, bacitracin, and erythromycin, which are known to poorly penetrate the outer membrane of Gram-negative bacteria (Fig. 6c). Together, these data indicate that bypass of PBPs by YcbB was associated with the permeabilization of the outer membrane in the presence of ceftriaxone. This implies that the mode of action of β-lactams may involve a positive loop in which binding of the drugs to their targets promotes drug access to the periplasm. Damage to the outer membrane mediated by reactive oxygen species (ROS) may be involved in this process since increased lipid peroxidation was detected by a colorimetric assay (Supplementary Fig. S7h)./p> transposome® (Lucigen). For each electroporation, transformed cells were incubated at 37 °C for 1 h in 2 ml of BHI broth supplemented with 10 µg/ml tetracycline and 20 µg/ml chloramphenicol. Cells were plated on 20 BHI agar plates (100 µl per plate) supplemented with 50 µg/ml kanamycin, 40 µM IPTG, and 1% l-arabinose in the absence (condition −CRO) or presence (condition +CRO) of 8 µg/ml ceftriaxone. Plates were incubated at 37 °C for 16 h (condition −CRO) or 24 h (condition +CRO). Cells were recovered from sets of 20 plates (corresponding to the same electroporation) in two steps by scrapping with 4 ml of BHI broth containing 20% glycerol followed by an additional wash of the plates with 4 ml of the same medium. The bacterial suspensions obtained for each electroporation were kept at −80 °C. For the −CRO condition, a total of 810,000 CFUs was obtained in 7 electroporations. For the +CRO condition, a total of 260,000 CFUs was obtained in 10 electroporations./p> 0.05 or a fold-change < 4 were eliminated. The resulting set of 179 genes is listed in Supplementary Data File 1b. For pathways or gene clusters containing selectively essential genes in the +CRO condition, we also considered non-essential genes displaying a significantly reduced number of insertions in the +CRO condition (p < 0.05). These genes were deemed to incur a fitness cost./p>